Spectrofotometria este o ramură a spectroscopiei care se ocupă cu măsurarea cantitativă a proprietăților de reflexie sau de transmisie ale unui material (substanță) în funcție de lungimea de undă. Termenul de spectrofotometrie este specific măsurătorilor în care este utilizată radiația electromagnetică din spectrul infraroșu (IR), vizibil (VIS) și ultraviolet (UV), ea făcând astfel parte din spectroscopia electromagnetică. În practică, metoda se bazează pe proprietatea de absorbție sau de transmisie a compușilor chimici la diverse lungimi de undă. Astfel, spectrofotometria este folosită atât ca metodă calitativă pentru identificarea prezenței unei substanțe într-o soluție, cât și cantitativă pentru identificarea concentrației unei substanțe dintr-o soluție. De asemenea, metoda poate fi utilizată pentru determinarea constantei de echilibru a unei soluții. Într-o reacție chimică, echilibrul chimic este starea în care ambii reactanți și produși sunt prezenți în concentrații care nu mai manifestă tendința de modificare în timp. De obicei, această stare se atinge când reacția directă are loc cu aceeași rată ca și reacția inversă. Ratele de conversie a reacției directe și a celei inverse sunt diferite de zero dar, fiind egale, nu există modificări nete ale concentrațiilor reactantului și produsului. Acest proces se numește echilibru dinamic. Din punct de vedere spectrofotometric, determinarea concentrațiilor reactanților și produșilor într-o astfel de situație, presupune măsurarea luminii transmise de către soluție. Orice compus chimic absoarbe, transmite sau reflectă lumină (radiație electromagnetică) în cadrul unui interval de lungimi de undă. Aparatele destinate acestor măsurători se numesc spectrofotometre.

Spectrofotometrul este un instrument capabil să măsoare cu precizie cantitatea de fotoni (intensitatea luminii) absorbită de trecerea lor printr-o probă (soluție). Astfel, se poate determina indirect și cantitatea de substanță (concentrația). În funcție de spectrul lungimilor de undă pe care le emite sursa de lumină, spectrofotometria are două variante: – UV/VIS utilizează lungimi de undă cuprinse între 185 – 400 nm (UV) și 400 – 750 nm (VIS). – IR utilizează lungimi de undă cuprinse între 750 nm – 1000 µm.

Spectrofotometria UV/VIS este utilizată cel mai frecvent în chimia analitică pentru determinarea cantitativă:

1) A soluțiilor ce conțin cationi ai metalelor tranziționale, majoritatea fiind colorate (absorb radiații electromagnetice din spectrul vizibil) datorită electronilor de pe orbitalii de tip d care pot fi ușor excitați fiind astfel determinați să execută tranziții cuantice. Culoarea soluțiilor ce conțin astfel de cationi poate fi însă afectată de prezența unor anioni sau liganzi. De ex. soluția de CuSO₄ de culoare albastră deschis poate fi intensificată cu ajutorul amoniacului care poate să schimbe maximul de absorbție.

2) A compușilor organici, în special aceia care manifestă un înalt grad de conjugare (sisteme cu orbitali p în care alternează legături simple cu cele multiple și care, în general, scad energia totală a moleculei, crescându-i astfel stabilitatea). De ex. ADN, ARN și proteinele absorb radiația electromagnetică mai ales din spectrul UV și foarte rar din cel vizibil. Pentru aceste determinări, ca solvent, se folosește de cele mai multe ori etanolul pentru că absoarbe mult mai puțin decât apa

Principiul spectrofotometriei UV/VIS se bazează pe legea Lambert-Beer. Această lege prevede că cantitatea de lumină absorbită de o soluție este expresia unei funcții exponențiale a concentrației și a lungimii de undă în raport cu acea soluție. Calibrarea metodei pentru o anumită substanță implică două etape distincte:

1. Se determină maximul de absorbție al substanței respective făcând un scanning a lungimilor de undă în concordanță cu culoarea acesteia. Dacă substanța este incoloră, se identifică o reacție de culoare specifică acesteia și se analizează produsul colorat.
2. Se determină relația dintre concentrația substanței luată în analiză (sau a produsului rezultat dacă e vorba de o reacție de culoare) și absorbție. Această determinare se face la lungimea de undă ce corespunde maximului de absorbție determinat la etapa 1.

OBSERVAȚII

Identificarea lungimii de undă ce manifestă absorbție maximă trebuie realizată pe o probă a cărei concentrație nu determină la această lungime de undă o absorbție mai mare de 1. Valorile convenabile pentru absorbție sunt situate între 0,1 și 1. Peste această valoare efectul de umbrire al particulelor poate modifica corectitudinea rezultatelor. Această situație implică concentrații prea mari în care particulele componente ale soluției, fiind prea apropiate, se pot afla una în spatele celeilalte și nu contribuie la absorbție. De aceea, pentru o substanță oarecare, identificarea acestei concentrații se face prin încercări.

Laboratorul de spectrofotometrie din cadrul Universității Apollonia din Iași, sediul din Str. Muzicii nr. 2, etaj 4, are în dotare un Spectrofotometru de mare performanțăT60, produs de PG Instruments

(http://www.pginstruments.com/images/brochures/spectrophotometer.pdf )